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BCA蛋白濃度檢測原理、操作及常見問題

一、實驗原理

BCA與二價銅離子的硫酸銅等其他試劑混合一起即為BCA工作試劑。在堿性條件下， BCA工作液與蛋白質結合時，蛋白質將二價銅離子還原為一價銅離子， 一個一價銅離子螯合兩個BCA分子，工作試劑變色，在562nM處有高的光吸收值，并與蛋白質濃度成正比，據此繪制標準曲線，檢測蛋白的OD值，即可得到濃度值。

二、應用范圍

1. BCA法測定蛋白濃度可以兼容樣品中高達5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween20、60、80。但本試劑盒受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響，需確保EDTA低于10mM，無EGTA，二硫蘇糖醇(DTT)低于1mM，β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol)低于0.01%。（tips：認真看說明書， 不僅是BCA檢測試劑盒說明書， 還有蛋白裂解液說明書， 清楚裂解液的試劑配方， 如果不適用BCA法，可以考慮其他方法測定蛋白濃度）

2. 靈敏度高， 檢測濃度下限達到25μg/ml，最小檢測蛋白量達到0.5μg，待測樣品體積為1-20μl。

3. 在50-2000μg/ml濃度范圍內有較好的線性關系，因此樣品濃度過高需適當稀釋。

三、實驗準備

1. BCA蛋白濃度測定試劑盒

2. PBS緩沖液

3. 96孔板

4. 酶標儀

5. 37℃恒溫培養箱

四、試劑配置

1. 蛋白標準品： 5mg/ml BSA

完全溶解蛋白標準品，取5mg/ml BSA蛋白標準品10μl，加入90μl的PBS稀釋為0.5mg/ml BSA（Tips：稀釋后的0.5mg/ml BSA蛋白標準可以一次全配好，分裝后-20℃長期保存）。

2. BCA工作液配制

根據樣品數量和重復次數， 200μl每孔計算所需工作液的體積。 BCA工作液按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量，充分混勻（Tips：由于加樣誤差適當多配一些，配好的BCA工作液室溫在24小時內穩定，因此可以在提蛋白前配好）。

五、實驗操作

1. 蛋白標準品濃度梯度配制

2. 加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中。如果樣品不足20μl，需加PBS補足到20μl。（Tips：記錄加入待檢測樣品的體積）

3. 各孔加入200μl BCA工作液， 96孔板震蕩30sec，37℃恒溫培養箱放置30分鐘。（Tips：也可以室溫放置2 小時。 BCA法測定蛋白濃度時，顏色會隨著時間的延長不斷加深。并且顯色反應會因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或適當延長孵育時間）

4. 用酶標儀測定562nM的吸光度（Tips：也可以使用分光光度計測定）。

5. 以蛋白含量(μg）為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪出標準曲線，根據標準曲線和使用的樣品體積計算出樣品的蛋白濃度。

六、常見問題

1. 測定標準曲線時發現隨著標準品濃度的增加吸光度或顏色沒有明顯變化?？赡艿脑蚴菢悠分泻袊乐馗蓴_BCA法測定蛋白濃度的物質。

2. 建議每次測定時都做標準曲線。因為BCA法測定時顏色會隨著時間的延長不斷加深，并且顯色反應的速度和溫度有關，所以除非精確控制顯色反應的時間和溫度，否則如需精確測定宜每次都做標準曲線。

3. 一般提取的蛋白濃度應該在多少μg/μl？組織在1-30μg/μl，細胞低一些大概0.1-10μg/μl。

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